AMBExpress

Mar27

IF：2.

实体肿瘤的生理特性在很大程度上决定了它们对抗癌治疗的反应。异常的血管系统是肿瘤的一个重要特征，它导致肿瘤的血管网络不充分和不均匀。当肿瘤的指数增长超过支持性血管网络的增长时，实体肿瘤内的这种功能异常的血管系统就会发生。肿瘤中新形成的血管高度不规则且组织不良，导致肿瘤核心形成低氧分压(≤0.1%氧气)、缺氧和坏死区域。

系统化疗给药是无效的，因为不能扩散到肿瘤血管之外很远处，并且会在实体肿瘤的缺氧区内形成次优的抗癌药物治疗浓度。抗肿瘤治疗蛋白的靶向递送正在开发中，然而，由于血管系统不足，特别是在实体肿瘤的缺氧区，其适用性仍然有限。此外，缺氧的肿瘤细胞通常是缓慢或不增殖的，因此，它们对传统的癌症化疗药物表现出抗药性。

这种情况促使人们寻找能够选择性靶向、复制并在全身给药后主动移动到肿瘤缺氧区的活性或细胞药物输送载体。不同属的细菌载体已经被证明在体内全身或口服给药后特异性地定植于实体肿瘤的缺氧区域。最常用的肿瘤靶向细菌载体是梭状芽孢杆菌属、双歧杆菌属和鼠伤寒沙门氏菌属。双歧杆菌和梭状芽孢杆菌是严格的厌氧菌，它们在给药后优先定位于缺氧肿瘤区域。鼠伤寒沙门氏菌是最广泛使用的细菌类生物大肠杆菌的近亲，因此很容易进行基因操作。鼠伤寒沙门氏菌是一种兼性厌氧细菌，与梭状芽孢杆菌和双歧杆菌相似，多项研究表明它在体内肿瘤中积累。尽管从理论上讲，这些生物能够在有氧环境中定居，但研究表明，沙门氏菌在肿瘤组织中选择性地积累，可能是由于氨基酸和核苷酸等代谢物引发的趋化作用，这些代谢物在肿瘤的缺氧/坏死区释放，并支持这些部位的生长。

鼠伤寒沙门氏菌是一种致病微生物，当系统给药野生型菌株时，可能会引起严重的副作用，如内毒素血症。出于这个原因，鼠伤寒沙门氏菌疫苗株已经被开发出来，其毒力降低，肿瘤靶向性提高。这是通过破坏Puri基因，导致嘌呤营养不良来实现的。由此产生的鼠伤寒沙门氏菌VNP除了在基因上减毒外，在肿瘤中的蓄积增加了三个数量级，诱导感染性休克的能力显著降低。

本研究利用鼠伤寒沙门氏菌VNP表达和分泌细菌抗肿瘤蛋白天青素样蛋白Laz，这是一种脂质修饰的天青蛋白。在病原菌中，天青素以两种形式存在，一种是铜绿假单胞菌中常见的周质形式，另一种是在淋球菌和脑膜炎球菌中以表面暴露的修饰形式存在。在奈瑟氏菌中，天青素是由于N-末端部分存在一个39个氨基酸的脂化肽(H.8表位)的延伸而显示在表面的。表面暴露使Laz能够结合脑瘤细胞的关键成分来破坏它们的紧密连接，并允许Laz进入肿瘤内部发挥细胞毒性。天青素和Laz对癌细胞显示出显著的细胞毒性，而对正常细胞几乎没有观察到的细胞毒性。它们可以优先进入癌细胞并与肿瘤抑制蛋白p53结合。这种复合物的形成通过保护p53免受泛素化和降解来稳定p53。Laz还通过抑制受体酪氨酸激酶EphB2的磷酸化来抑制癌细胞的生长，EphB2通常在癌细胞中高表达；此外，Laz还具有抑制血管生成的能力。

为了证实VNP-Laz在缺氧条件下表达和输出可检测到的Laz，将pBsKSII-HIP-LAZ转化鼠伤寒沙门氏菌VNP，在缺氧和常氧条件下培养24小时。以纯化的Laz作为阳性对照。

用抗Lip/H.8mab2c3血清进行免疫印迹显示，只有在缺氧条件下生长VNP-Laz时才检测到Laz，而在常氧条件下检测到Laz的程度要低得多(图1)。

用pBsKSII-HIP-LAZ转化的VNP-LAZ(鼠伤寒沙门氏菌VNP表达-LAZ)仍含有相当数量的治疗蛋白LAZ与细胞结合。然而，在常氧条件下，在细菌细胞球中没有检测到或可以忽略不计的LAZ(图2)。

纯化的Laz被证明可以进入人类癌细胞，稳定p53以提高其细胞内水平，并在体外诱导癌细胞死亡。因此，如果给药得当，Laz可用于诱导肿瘤细胞凋亡。

用减毒沙门氏菌VNP-Laz株感染三种不同的癌细胞系：乳腺癌细胞系MCF-7作为野生型p53非脑癌细胞的代表，脑癌细胞系U-作为具有突变p53的胶质母细胞瘤细胞的代表，以及LN-作为野生型p53胶质母细胞瘤细胞的代表，来测试减毒沙门氏菌VNP-Laz菌株向脑肿瘤细胞和非脑肿瘤细胞表达和释放的Laz具有细胞毒性，并能诱导癌细胞凋亡；确认表面暴露的Laz及其H.8表位破坏进入屏障的能力，使细菌细胞能够进入脑肿瘤通过与肿瘤抑制蛋白（p53）相互作用诱导细胞凋亡。

随着接种液中细菌数量的增加，乳腺癌细胞MCF-7(图3)、胶质母细胞瘤细胞LN-(图4)和U-(图5)共同孵育24小时后荧光强度增加。VNP-Laz诱导的细胞凋亡水平明显高于VNP单独诱导的细胞凋亡水平，因此荧光强度明显高于VNP单独诱导的细胞凋亡水平。

当同样的癌细胞株(MCF-7，LN-，U-)作用于纯化的Laz蛋白(≥1μg/ml^?1)时，癌细胞显示caspase3/7活性显著增加(图6)，表明诱导凋亡，尽管低于VNP-Laz诱导的活性。这表明载体菌株表达和输出Laz的效率高于使用纯化Laz的浓度。Laz对乳腺癌和胶质母细胞瘤细胞的作用均呈剂量依赖性，但在胶质母细胞瘤U-细胞中的作用低于MCF-7和LN-细胞，提示其诱导凋亡是由p53介导的。

VNP-LAZ诱导的细胞凋亡水平的提高清楚地表明，在低氧条件下，细菌表达并输出了功能性LAZ。

鼠伤寒沙门氏菌VNP-(VNP)是一株非致病性减毒沙门氏菌，作为兼性厌氧菌，优先聚集在实体瘤的缺氧区。在这里，VNP被用作抗肿瘤蛋白脂化天青素(Laz)的载体，Laz是由引起脑膜炎的奈瑟菌脑膜炎杆菌产生的。Laz基因及其信号序列被克隆到缺氧诱导启动子(HIP-1)的下游，然后被电穿孔到VNP中，证实VNP在低氧条件下成功异位表达和输出了Laz蛋白。与纯化的Laz相比，VNP-Laz显著诱导MCF-7、LN-和U-细胞凋亡。我们的结果可能代表了一种新的靶向基因传递途径，并提示了其在脑肿瘤治疗中的潜在应用。

Reference:Bacterialdeliveryoftheanti-tumorazurin-likeproteinLaztoglioblastomacells

PMID:

DOI:10./s---8