作为最小（直径0.3-0.8um）最简单的原核生物，支原体存在于哺乳动物的囊泡中，它是细胞培养过程中常见的污染源。约30%的细胞培养中存在15-80%的支原体污染，每mL可高达个菌落。与常见的细菌不同，支原体的细胞膜有三层，但是无细胞壁，这使它们对青霉素及其类似物产生抗性。

支原体侵染可能剥夺宿主细胞的精氨酸来作为它能量来源和将核算前提并入宿主细胞的一种必须的氨基酸。支原体粘附可能会引起宿主细胞渗漏，干扰膜受体和信号转导功能。瞬时侵染可能涉及质粒DNA的内吞作用，它也可能会影响这个过程。

被支原体侵染的细胞发育迟缓、生长异常、出现“蛀虫‘’型的单层边缘。其他细胞可能出现类似营养饥饿的变化，这可以通过频繁更换培养基来缓解。不幸的是，并非所有的污染都可以通过形态学变化来识别。

许多检测方法已经被开发，包括在肉汤培养基上培养微生物，使用DAPI进行DNA荧光染色，用支原体rRNA特异性的探针进行杂交，ELIAS检测，用6-MPDR进行生物化学检测和PCR。这些方法中，PCR是简便灵敏的。Hopert等人报道称与DAPIDNA荧光染色，ELISA和DNA-RNA杂交比，PCR产生较少的假阳和假阴性。此外，当样品被稀释时，PCR也具有高的灵敏性。比较这四种检测方法表明，（a）微生物的培养是比较耗时的，大概需要1到4周；（b）由于污染菌体和断裂的核酸的存在，DNA荧光染色并不准确；（c）在杂交反应中，革兰氏阳性菌的存在可能会引起非特异性的信号干扰。（d）PCR可以快速较好地检测3-CFU/mL。PCR可以准确检测20-CFU/mL的支原体。大部分PCR方法引物设计结合在原核生物16S和23SrRNA保守的位置，扩增16S和23SrRNA之间的区域。这个区间的长度和序列因物种而异。通过凝胶电泳或者二轮PCR可以识别这些污染源。

一旦检测到污染，建议高压灭菌培养箱，更换无支原体污染的培养箱。然而，没有无支原体的培养箱可用时，从被侵染的细胞中清除支原体就势在必行。支原体清除方法主要有四种：（a）物理方法，比如热激和光敏；（b）化学方法，比如用氯仿清洗，或者用含6-MPDR的培养基培养；（c）免疫方法，用特异性抗支原体抗体的血清；（d）化学疗法，比如在标准培养基或者琼脂糖培养基上加入抗生素。培养基中加入抗生素似乎是经济有效的，去除率可以超过75%。一些抗支原体的试剂，如喹诺酮和四环素，是商业化可用的。这些试剂抑制核酸和蛋白质的合成。在Fleckenstein的实验中，对一种抗生素产生抗性的支原体可以用另一种抗生素来清除。比较了几种抗生素试剂，BM-cyclin是tiamulin和minocycline的综合，都会抑制蛋白质的合成，它与其他清除剂如Sparflox,Enroflox,Ciprololx比有较高的效率。

许多年来在我们的实验室里，我们使用十几种细胞系来研究生理学和肿瘤生物学。然而，最近发现细胞生长缓慢，培养基快速酸化，转染效率降低，猜测这可能与支原体污染相关。本文展示了我们成功地检测和处理支原体污染的细胞系。

细胞培养

本研究用到的细胞系包括人卵巢癌细胞（BG1，SKOV3，OVCAR3，BR，67R，CaOV3），绒毛膜癌（JEG3，BeWo），乳腺癌细胞（MCF-7，T47D），子宫内膜癌细胞（KLE，RL-），宫颈癌癌细胞（HeLa），胚胎肾细胞（），和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）。解冻后，一部分细胞系直接离心然后培养，另一部分用于DNA提取。细胞培养时，细胞系（Table1,都是粘附细胞），细胞在25cm2的培养箱中培养，培养基为D-MEM/F-12(GibcoBRLLifeTechnologies,#-,Karlsruhe,Germany)，含10%胎牛血清（(FBS;GibcoBRL,#-），units/ml的青霉素和ug/ml的链霉素（(GibcoBRL,#-）。培养温度为37℃，CO2含量为5%，且对湿度有一定的要求。

DNA提取

提取使用QIAampDNABloodMidiKit(Qiagen,#,Hilden,Germany)，按照说明书使用即可。

巢式PCR

支原体污染检测使用PCR支原体检测试剂盒（Takara,#,Shiga,Japan）。简言之，第一轮PCR扩增扩增16S和23SrRNA之间的区域（F:5-ACACCATGG-GAGCTGGTAAT-3;R:5-CTTCATCGACTTTCAGA-CCCAAGGCAT-3）。第二轮巢式PCR引物结合在第一轮扩增区域保守的序列（F:5-GTTCTTTGAAAAC-TGAAT-3;R:5-GCATCCACCAAAAACTCT-3）。支原体种类不同，第一轮PCR产物长度范围为-bp，二轮PCR长度为-bp。DNA使用量为-ng，每次PCR使用阴性对照。Taq聚合酶品牌货号为Takara,#RA，PCR仪品牌为AppliedBiosystemsGeneAmpPCRSystem。一轮和二轮PCR产物分别用1.5%和2%的琼脂糖进行凝胶电泳，染料使用EB。

DAPI染色

荧光染料（DAPI）（Sigma,#D-,Deisenhofen,Germany）用水溶解至1mg/ml的储存浓度，使用时用甲醇稀释至1ug/mL。细胞在覆盖有纤连蛋白的载玻片小室内（Nunc,#,Wiesbaden,Germany），用培养液冲洗一次，置于37℃，15min,用甲醇冲洗一次。载玻片用甘油固定，置于荧光显微镜，用/nm的激发滤光片和LPnm阻挡滤光片观察（Olympus,BX50,Japan）。或者用激光共聚焦显微镜（LeicaTCSSP2,Germany）来进行观察。

支原体清除

两个支原体污染的细胞系BR和67R，用BM-cyclin(Roche,#,Mannheim,Germany)处理，简言之，加入终浓度10ug/ml的BM-cyclinI处理3天，然后加入BM-cyclinII(tetracy-clineminocycline)处理4天。重复三次。

PCR检测支原体污染

在被检测的15个细胞系（表1）中，有6个被检测有支原体污染，它们一轮和二轮PCR扩增出bp和bp的条带（图1）。结果也表明，所有被污染的细胞均是被同一种支原体M.hyorhinis污染。

表1

图1从细胞和培养基中提取的DNA检测灵敏度比较。八对分别来自培养基和细胞系提取的DNA作为PCR的模板。一轮PCR出现bp产物和/或二轮PCR出现bp产物说明有支原体污染。

用BM-cyclin处理清除支原体

在处理前，所有的细胞均生长抑制。当用DAPI染色时，可以清晰地看到散布在细胞质中的支原体DNA。在一些严重感染的细胞中，支原体甚至已经泄露出细胞（图2和3）。用BM-cyclin处理后，细胞用DAPI染色和PCR检测（图4）。DAPI染色表明处理过的细胞已经完全没有支原体污染（图2和3）。然而，如图4下图中第8道，PCR结果显示在BR细胞中还仍有少量的支原体残留。这些残留的支原体明显是死亡的支原体，对细胞无害。处理后的细胞继续培养3周后，检测不到支原体。

图2卵巢癌BR细胞用BMCyclin抗生素处理前后DAPI染色检测支原体DNA。BR细胞在玻璃室载玻片上培养，抗生素处理前（A-C）和处理后（D-F）分别用1ug/ml的DAPI染色。明场（A,D），荧光场（B，E）,Dic显微镜（C,F）放大倍数为X。B图中，被感染的细胞细胞质中支原体用黄色箭头指示，泄漏到宿主细胞外的支原体DNA用绿色箭头指示。

图3卵巢癌67R细胞用BMCyclin抗生素处理前后DAPI染色检测支原体DNA。67R细胞在玻璃室载玻片上培养，抗生素处理前（A-C）和处理后（D-F）分别用1ug/ml的DAPI染色。明场（A,D），荧光场（B，E）,Dic显微镜（C,F）放大倍数为X。B图中，被感染的细胞细胞质中支原体用黄色箭头指示，泄漏到宿主细胞外的支原体DNA用绿色箭头指示。与未被感染的细胞（D,F）比，支原体感染的细胞（A,C）有较高的粒度。在图B中，被感染的细胞质中支原体的DNA用黄色箭头标识，一些泄漏到宿主细胞外的支原体DNA用绿色箭头标识。

图4抗生素清除感染的细胞中支原体的效率。卵巢癌细胞67R和BR用BM-Cyclin处理前后提取的基因组DNA作为巢式PCR的模板。第8道二轮PCR有bp产物表明处理后的BR细胞中有残余支原体DNA存在（在正文中有讨论）。

HsuanJung;Shih-YeeWang1;I-WenYang,MSetal.DetectionandTreatmentofMycoplasmaContaminationinCulturedCells.ChangGungMedJ3;26:-8.

RottemS,BarileMF.Bewareofmycoplasmas.TrendsBiotechnol;11:-51.

UphoffCC,DrexlerHG.Detectionofmycoplasmainleukemia-lymphomacelllinesusingpolymerasechain

reaction.Leukemia2;16:-93.

Eliminationofmycoplasmafromleukemia-lymphomacelllinesusingantibiotics.Leukemia2;16:-8.

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