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随着分子生物学技术的不断发展和需求的多样化，用于核酸检测的各种PCR衍生技术应运而生。江西省重点分子实验室是省内最早引进（年）、荧光定量升级（年）并数字化（年）PCR技术的实验室。数字PCR是一项基于PCR技术的全新核酸检测技术，其具有绝对定量、高灵敏度等优势，广泛用于:（1）稀有突变检测；（2）拷贝数变异；（3）microRNA表达；（4）测序文库绝对定量；（5）无创产前筛查；（6）评估基因编辑效率。目前，我们实验室率先在省内将数字PCR技术应用于肿瘤靶向突变基因的检测。

一、数字PCR作用原理

数字PCR（DigitalPCR，dPCR）的作用原理是将含有核酸分子的反应体系进行极限稀释，通过控制阀门或微滴生成器分散成为体积可小至皮升级的反应单元，每个反应单元作为一个独立的PCR反应器，其中含有或不含待检靶标分子(DNA或RNA)，在PCR扩增结束之后，采集每个反应单元信号，并以终点信号的有无作为判断标准(有荧光信号的液滴判读为“1”，无荧光信号的微滴判读为“0”)，最后根据泊松分布（Poissondistribution）原理计算待检靶标分子的浓度或拷贝数。dPCR的定量原理相对简单，不需要标准曲线，即能够对样本中核酸进行绝对的定量。图1.数字PCR作用原理

目前，市场上应用广泛的数字PCR平台有RainDance、Bio-RAD、QuanStudio3D等。本实验室依托Life-technologies推出的QuantStudio3D数字PCR系统，实现了对肿瘤靶向突变基因的检测。

图2.3D数字PCR仪具体操作步骤：图3.3D数字PCR的操作过程

3D数字PCR技术对非小细胞肺癌EGFR-TM基因进行检测的结果分析：EGFR-TM突变率为2.58%。

图4.EGFR-TM3D数字PCR结果分析二、数字PCR的应用领域

dPCR作为继荧光定量PCR之后生命科学领域的又一创新，正以其独特的技术优势不仅在转基因植物检测、食品安全、农业与环境监测领域，而且在人类疾病诊断和基因编辑等医学领域发挥着重要作用。

1.dPCR在人类疾病诊断中的应用

随着分子生物学技术的迅速发展和人类全基因测序的完成，研究发现某些肿瘤是由基因片段缺失、插入、突变或表观遗传修饰造成，而这种变异仅发在肿瘤细胞上，因此可将这种变异作为鉴定肿瘤发生的标记物。当人有一个或多个特定基因组区域出现缺失/复制时，就会发生拷贝数的变异(copynumbervariations,CNVs)，这种CNVs可以自然发生，但在人类中可用作疾病状态的指示。因此，dPCR可应用于肿瘤早期诊断、产前筛查及感染性疾病的判定。在对唐氏综合征(downssyndrome,DS)和乳腺癌(breastcancer)等由非整倍体改变而致病的疾病诊断中，使用dPCR方法可更为精确地检测到微小的倍数变化。镰状细胞贫血(sicklecellanemia)是一种由HBB基因突变引起的常染色体显性遗传病，dPCR方法作为精准有效的无创产前诊断是预防镰状细胞贫血患儿出生的有效方法。

2.dPCR在基因编辑领域的应用

基因编辑是近年来一个重大的技术突破，该技术已经广泛应用于基因功能研究、人类疾病治疗、物种改良等多个方面。定性及精确定量评估基因编辑实验是否成功仍是一大难点。在已知编辑背景信息的情况下，基因编辑频率dPCR利用两个不同标记的探针，同时对给定样本中编辑的和野生型等位基因进行定量，该方法可与定点测序结果相互验证。医学上dPCR主要应用在对人类细胞系基因组编辑效率进行检测。

目前实验室开展PCR检测项目：

病原体微生物基因检测

乙肝定量PCR（HBV-DNA）

丙肝定量PCR（HCV-RNA）

解脲支原体PCR检测（UU-DNA）

沙眼衣原体PCR检测（CT-DNA）

手足口病PCR检测（EV71，CA16，肠道病毒）

单纯疱疹病毒PCR检测（HSV-DNA）

淋球菌PCR检测（NGH-DNA）

人乳头瘤病毒核酸分型检测（HPV-DNA）

呼吸道病原菌核酸检测

肿瘤靶向药物基因检测

人类EGFR基因突变检测

人类KRAS/NRAS基因突变检测

人类BRAF基因VE突变检测

人类EML4-ALK融合基因检测

人类EGFR/ALK/ROS1基因突变联合检测

ROS1融合基因检测

药物代谢基因检测

亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因检测

CYP2C19基因检测

CYP2C9和VKORC1基因检测

ApoE和SLCO1B基因多态性检测

HLA-B*27基因分型检测

HLA-B*基因检测

供稿：邹叶青、陈志青

排版：胡建平

审核：洪葵

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