常见生殖道病原体核酸检测技术

性传播疾病(STD)是主要通过性接触传播的一类泌尿生殖道感染性疾病,是现今大多数国家最普遍的感染性疾病。近年来,随着国家经济的发展,人际交流日趋频繁,人口流动逐渐增加和性观念开放,STD在我国感染率呈增长趋势,严重影响着人们的身心健康与生活质量。生殖道病原体主要包括解脲脲原体(Uu)、沙眼衣原体(CT)和淋病奈瑟菌(NG)三种。

STD感染常引起泌尿生殖道感染,女性患者常引起免疫缺陷、癌症、不孕、早产、死胎;男性患者可引起不育、附睾炎、前列腺炎等疾病。因此,定期进行检测STD,能及时反映本人STD的感染情况,对制定STD防治策略具有重要的指导意义。

在性传播疾病中,淋球菌(NGH)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)较常见。医院目前多采用病原体培养、免疫学检测或常规聚合酶链反应(PCR)等方法进行检测。培养虽然特异性较高,但所需时间长,而且有些病原体如UU培养灵敏度较低。用免疫学方法检测病原体抗原灵敏度低,约需要-个病原体才可检测到。检测抗体一是存在“窗口期”问题,同时不能判定是现症感染还是既往感染。常规PCR虽简便、快捷,但存在不能定量,易交叉污染等缺点。

医院中心实验室引进了实时荧光定量PCR方法,取得了较好的效果。

荧光定量PCR原理:该技术在常规PCR基础上,加入了一条用荧光基团标记的特异性探针。其探针5′端标记荧光报告基团,3′端标记荧光抑制基团。两者构成能量传递结构,即探针完整时,抑制基团吸收或抑制了报告基团的荧光,故检测不到荧光或荧光信号无改变。当有特异性PCR扩增发生时,在退火过程中,探针与引物同时结合于模板上,引物延伸时,探针被Taq酶的5′活性作用切断,这时发生能量转移,抑制基团的作用消失,报告基团荧光信号增长,被切断的荧光探针的量与被扩增的目的基因的量呈一一对应关系。因此,荧光信号伴随着PCR产物的增长而增长。实时定量荧光PCR方法就是利用此原理,在PCR过程中,连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一阈值(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差,计算出99.7%的置信度大于平均值的荧光值,即为阈值)时,此时的循环次数(Ct值)就被记录下来。该循环参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度标准品的Ct值制成标准曲线,再根据样品的Ct值就可以准确测定出起始DNA拷贝数。

因此,荧光定量PCR除了有快速、操作简便,不需对PCR产物进行后处理,从而防止了扩增产物污染等优点外,还具有定量范围宽、定量准确等优点。

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